Lekársky obzor

najstarší lekársky odborný časopis na Slovensku - V každom čísle získajte 2 kredity

  • Zväčšiť veľkosť písma
  • Predvolená veľkosť písma
  • Zmenšiť veľkosť písma
Home Lekársky obzor 2011 Lekársky obzor 3/2011 Príspevok k farmakologickému ovplyvneniu oxidačného vzplanutia neutrofilov

Príspevok k farmakologickému ovplyvneniu oxidačného vzplanutia neutrofilov

E-mail Tlačiť PDF
  • Príspevok k farmakologickému ovplyvneniu oxidačného vzplanutia neutrofilov
  • Rado NOSÁĽ, Katarína DRÁBIKOVÁ, Viera JANČINOVÁ, Tatiana MAČIČKOVÁ, Jana PEČIVOVÁ, Tomáš PEREČKO
  • Lek Obz, 60, 2011, č. 3, s. 114 – 119

SÚHRN
Východisko: Neutrofilné leukocyty predstavujú profesionálne fagocytárne bunky, ktoré sa rozhodujúcou mierou podieľajú na oxidatívnom vzplanutí a podstatne prispievajú k celému radu patologickch stavov.
Súbor: V práci sme overili účinok dvoch terapeuticky používaných liečiv a štyroch prírodných látok (cyklické polyfenoly) na mechanizmus oxidatívneho vzplanutia ľud­ských neutrofilov z hľadiska ich účasti na mechanizme tvorby reaktívnych foriem kyslíka.
Metódy: Na charakterizáciu oxidačného vzplanutia a tvorby reaktívnych foriem kyslíka v plnej ľudskej krvi a izolovaných neutrofiloch sme použili metódy chemiluminiscencie, akti­vácie kaspázy 3, stanovenie aktivity proteinkinázy C, tvorby superoxidového aniónu a aktivity myeloperoxidázy.
Výsledky: Oxidatívne vzplanutie v ľudskej krvi po stimulácii znížili testované látky v poradí účinnosti: N-feruloylsérotonín>quercetín>kurkumín>arbutín>ditiadén> karvedilol. Tvorbu re­aktív­nych foriem kyslíka izolovaných neutrofilov intracelulárne ovplyvnili testované látky v tom istom poradí, karvedilol bol neúčinný. Zhášanie extracelulárnych foriem reaktívnych metabolitov kyslíka bolo v poradí účinnosti: N-feruloylséro­tonín>kurkumín>quercetín>ditiadén. Arbutín a karvedilol boli neúčinné. Všetky testované látky zvyšovali aktivitu kaspázy v bezbunkovom systéme, čo môže priaznivo ovplyvniť apoptózu neutrofilov. Aktiváciu proteinkinázy C neutrofilov významne znížil ditiadén, kurkumín, quercetín a N-feruloyl­sérotonín. Aktivovanú myeloperoxidázu neutrofilov význam­nejšie znížil karvedilol, ditiadén, quercetín a arbutín v po­rovnaní so znížením tvorby superoxidového aniónu, čo poukazuje na skutočnosť, že na znížení celkovej koncentrácie reaktívnych metabolitov kyslíka sa látky podieľajú aj iným mechanizmom, než bolo zistené potlačenie aktivácie proteinkinázy C.
Závery: Terapeuticky používaný karvedilol a ditiadén a prí­rodné látky rozdielne ovplyvnili oxidatívne vzplanutie krvných neutrofilov in vitro mechanizmom zasahujúcim do regulácie tvorby reaktívnych foriem kyslíka ako na extracelulárnej, tak aj intracelulárnej úrovni. Získané výsledky poukazujú na mož­nosť využitia farmakologického zásahu na aktivované neutro­fily v patologických procesoch. Pozoruhodný bol najmä účinok prírodných látok.
Kľúčové slová: ľudské neutrofily – oxidatívne vzplanutie – karvedilol – ditiadén – arbutín – kurkumín – quercetín – N-feruloyl-sérotonín.
Lek Obz, 60, 2011, č. 3, s. 114 – 119


 

  • On the pharmacology of the neutrophils oxidative burst
  • Rado NOSÁĽ, Katarína DRÁBIKOVÁ, Viera JANČINOVÁ, Tatiana MAČIČKOVÁ, Jana PEČIVOVÁ, Tomáš PEREČKO
  • Lek Obz, 60, 2011, 3, p. 114 – 119

SUMMARY
Rationale: Neutrophil leukocytes represent professional phagocytes which participate essentially in oxidative burst and contribute to many pathological events.
Essential: In this study we investigated the effect of two therapeutically used drugs and four natural polyphenolic compounds on the mechanism of oxidative burst of human neutrophils concerning they participation in the generation of reactive oxygen species.
Methods: The chemiluminescence method was applied for determination of oxidative burst in whole human blood and isolated neutrophils. Caspase-3 activation, protein kinase C determination, detection of superoxide anion and myeloperoxidase activation were used to elucidate molecular mechanisms of pharmacological intervention of the drugs investigated with neutrophils.
Results: The compounds investigated decreased the oxidative burst of whole blood in the rank order of potency: N-feruloyl-serotonin>quercetin>curcumin>arbutin>dithiaden>carvedilol. The generation of intracellular reactive oxygen species in isolated neutrophils was decreased in the same rank order, while carvedilol was ineffective. Scavenging of extracellular oxygen radicals followed the rank order of potency: N-feru­loyl -serotonin>curcumin>quercetin>dithiaden. Arbutin and carvedilol had no effect. All compounds tested increased the activity of caspase-3 in cell-free system indicating a positive effect on apoptosis of neutrophils. Activation of protein kinase C was significantly decreased by dithiaden, curcumin, quercetin and N-feruloylserotonin. Carvedilol, dithiaden, quercetin and arbutin reduced more significantly activated neutrophil myeloperoxidase release as compared with the less pronounced effect on superoxide generation. This suggests that other mechanisms, like protein kinase C, might participate in the inhibition of neutrophil activation.
Conclusion: Therapeutically used carvedilol and dithiaden and cyclic polyphenolic compounds of natural origin altered oxidative burst of neutrophils in vitro in different ways. This resulted from the inhibition of free oxygen radical production both at extra- and intracellular level. The presented results are indicative of pharmacological intervention with neutrophils in pathological processes. Of particular interest was the effect of natural compounds.
Key words: human neutrophils, carvedilol, dithiaden, arbutin, curcumin, quercetin, N-feruloylserotonin.
Lek Obz, 60, 2011, č. 3, s. 114 – 119


 

Úvod

Neutrofilné leukocyty sa rozhodujúcou mierou podieľajú na fagocytóze invadujúcich mikroorganizmov a po aktivácii produkujú superoxid (O2-) v procese oxidačného vzplanutia (“oxidative burst”) (29, 30). Na druhej strane značnou mierou prispievajú k patogenéze celého radu chorôb tvorbou reaktívnych foriem kyslíka (RMK), ako je ischemicko-reperfúzne poškodenie orgánov, zápal, neoplázia, diabetické komplikácie a ďalšie (3, 23). Všetky liečivá, ktoré sa po absorpcii dostanú do krvného obehu, sú bezprostredne v kontakte s krvnými elementmi a môžu ovplyvniť celý rad ich funkcií, aj keď ich primárny účinok je cielený inam. Blokátory beta­adrenergického receptora, histamínové H1 antagonisty a?chlorochín významnou mierou inhibujú agregabilitu ľudských krvných doštičiek in vitro mechanizmom súvisiacim s inhibíciou doštičkovej cytozólovej fosfolipázy A2 (18). Blokátory histamínového H1-receptora, karvedilol, tricyklické antidepresíva a ďalšie liečivá ovplyvňujú základné funkcie neutrofilných leukocytov in vitro (4, 19, 20, 24, 28).

Niekoľkoročnými cielenými štúdiami sme sledovali možnosť zásahu liečiv a prírodných látok do oxidatívneho vzplanutia ľudských neutrofilných leukocytov. V?práci podávame prehľad získaných výsledkov o pôsobení vybraných liečiv (karvedilol, ditiadén) a šty­roch prírodných cyklických polyfenolov v izomolárnej koncentrácii (10 µM) na mechanizmus tvorby reaktívnych foriem kyslíka v ľudskej krvi a izolovaných neutrofiloch in vitro.

Súbor a metódy

Použili sme luminol, izoluminol, PMA (4ß-phorbol-12ß-myristate-?13-acetate), fMLP (N-formyl-metionyl-leucyl-fenyl-alanín), superoxid dismutáza, dextran (priemerná m.h. 464 000), luciferáza z Photinus pyralis-firefly a D-luciferin sodná soľ: Sigma-Aldrich Chemie (Deisenhofen, Nemecko), HRP (horseradish peroxidase) a kataláza: Merck (Darmstadt, Nemecko), Lymphoprep (denzita 1,077 g/mL): Nycomed Pharma AS (Oslo, Nórsko).

Fosfátový tlmivý roztok (PBS) s obsahom: 136,9 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, 1,8 mM CaCl2 a 0,5 mM MgCl2x6H20, pH 7,4; Tyrodeho roztok s obsahom: 136,9 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 11,9 mM NaHCO3, 0,4 mM NaH2PO4x2H20, 1 mM, MgCl2x6H20 a 5,6 mM glukóza, pH 7,4.

Použité liečivá a prírodné látky: Carvedilol Roche (Mannheim, Nemecko), Dithiaden-Lečiva Praha, arbutín, kurkumín, quercetín (Sigma-Aldrich Chemie Deisen­hofen, Nemecko), N-feruloyl-sérotonín – ing. Harmatha ÚOCHB ČAV Praha, Caspase-Glo 3/7 Assay z firmy Promega (Madison, WI, USA), humánna kaspáza 3: (Enzo Life Sciences, Lausen, Switzerland).

Získanie krvi a separácia neutrofilov

Čerstvú krv sme získali od dobrovoľníkov – mužov (vek 20 – 50 rokov) bez medikácie 7 dní v krvnej banke venepunkciou do 3,8% roztoku trojsodného citrátu (pomer krv:citrát = 9:1) na základe povolenia etickej komisie NTS-KRA/2008/SM. Neutrofilné leukocyty sme izolovali diferenciálnou centrifugáciou v 3% dextráne s následnou separáciou cez Lymfoprep. Po hypotonickej hemolýze, premytí PBS a spočítaní (Coulter Counter, Electronics) sme suspenziu buniek zriedili na 104 neutrofilov/µL. Pracovná suspenzia obsahovala viac ako 96 % živých buniek (stanovené mikroskopicky ofarbe­ním trypanovou modrou) (4, 5).

Stanovanie chemiluminiscencie (CHL) plnej krvi a izolovaných neutrofilov. Oxidatívne vzplanutie profe­sionálnych fagocytov v krvi sme stanovili po stimulácii PMA (0,5 µM) v 250 µL vzorkách (5). Extra- a intra­celulárnu tvorbu reaktívnych metabolitov kyslíka (RMK) v izolovaných neutrofiloch sme stanovili pomocou lumi­nolom/izoluminolom zosilnenej CHL, opísanej v pre­došlých prácach (10, 11). Chemiluminiscenciu v plnej krvi a izolovaných neutrofiloch sme merali v mikro­doštičkovom luminometri Immunotech LM-01T (Česká Republika) pri 37 oC (11).

Aktivita kaspázy 3. Použili sme metodiku podľa návodu výrobcu a pracovali sme s izolovaným ľudským enzýmom kaspáza 3 (? Súbor a metódy). Testovali sme účinok látok na aktivitu purifikovaného ľudského enzýmu a stanovenie účinku testovaných látok na aktivitu kaspázy 3 sme merali pomocou luminiscenčnej metódy. Princípom stanovenia aktivity kaspázy 3 bolo meranie chemiluminiscenčného signálu, ktorý vzniká po rozštiepení Z-DEVD-aminoluciferínového substrátu kas­pázou 3 a po následnej reakcii uvoľneného amino­luciferínu s luciferázou (26).

Stanovenie aktivácie proteínkinázy C (PKC). Na stanovenie fosforylácie izoenzýmov proteínkinázy C ? a ßII sme použili metódu opísanú Jančinovou a spol. (13). Stručne: izolované neutrofilné leukocyty (5x106/vzorka) sme inkubovali s testovanými látkami, následne stimulovali PMA (0,15 µM, 1 min) a po lýze solubilizačným roztokom a sonikácii naniesli na poly­akrylamidový gél. Proteíny sme separovali elektrofore­ticky a preniesli na Immobilon P-Transfer Membranes (Millipore Corp., USA). Z dvoch prúžkov bola v jednom stanovená PKC (medzi 60 a 100 kD), v druhom ß-aktín (30 – 60 kD-interná kontrola). Prúžky membrán po spra­covaní boli vizualizované pomocou Enhanced Chemi­luminescence Western Blotting Detection Reagent (Amersham, UK). Radiogramy sme kvantifikovali pomo­cou Image J Programm korekciou PKC prúžkov s odpo­vedajúcimi pre ß-aktínový prúžok.

Aktivita superoxidového aniónu SO2- . Na meranie aktivity superoxidu sme použili metódu superoxid­dismutázou inhibovateľnej redukcie cytochrómu C. Suspen­ziu izolovaných neutrofilov (106) sme predinkubovali s liečivami, resp. prírodnými látkami 5 min pri 37 oC a následne stimulovali N-formyl-metionyl-leucyl-fenyl-alanínom (fMLP-0.1mM) 15 min. Po centri­fugácii (13 000xg, 2 min, 4 oC) sme zmerali absorp­ciu supernatantu pri 550 nm v spektrofotometri Hewlet Packard 8542 A pri 463 nm (24).

Stanovenie uvoľnenia myeloperoxidázy (MPO). Izolované neutrofily sme predinkubovali s cytochalazí­nom B (5 µg/mL) 5 min. Vzorky (106 neutrofilov) sme predinkubovali s liečivami, resp. prírodnými látkami pri 37 oC 5 min a stimulovali N-formyl-metionyl-leucyl-fenyl-alaninom (fMLP-0.1µM) 15 min. Aktivitu MPO sme stanovili po centrifugácii (982xg, 10 min, pri 4 oC) meraním oxidácie o-dianizidínu v prítomnosti peroxidu vodíka v spektrofotometri Hewlet Packard 8452 A pri 463 nm (25).

Spracovanie výsledkov

Získané numerické údaje výsledkov meraní boli spracované štatisticky progra­-mom ANOVA a významnosť výsledkov sa hodnotila na hranici významnosti pre p < 0,05 a 0,01.

Výsledky

Účinok liečiv a prírodných látok na oxidatívne vzplanutie v ľudskej krvi je znázornené na grafe 1. V izomolárnej koncentrácii (10 µM) najsilnejší inhibičný účinok na stimulovanú tvorbu RMK mali prírodné látky arbutín, kurkumín, quercetín a N-f-5HT. Viac ako 50% účinnosť mal karvedilol a ditiadén.

  • Graf 1. Účinok karvedilolu (CARV), ditiadénu (DIT), arbutínu (ARB), kurkumínu (KUR), quercetínu (QUER), a N-feruloyl-sérotonínu (N-f-5HT) v 10 µM koncentrácii na chemiluminiscenciu plnej ľudskej krvi stimulovanej forbol-myristát-acetátom (PMA-0,5 µM). n = 6, x + SEM, *p < 0,05, **p < 0,01
  • Figure 1. Effect of carvedilol (CARV), dithiaden (DIT), arbutin (ARB), curcumin (KUR), quercetin (QUER) and N-feruloyl-serotonin (N-f-5HT) in 10 mM concentration on the chemiluminescence (CHL) of human blood stimulated with phorbol-myristate-acetate (PMA-0.5 µM). n = 6; x + SEM, *p < 0.05, **p < 0.01

Graf 2 demonštruje účinok testovaných látok na extra- a intracelulárnu tvorbu RMK v izolovaných neutrofiloch stimulovaných PMA. Najmenej účinný na obidve zložky RMK bol karvedilol v koncentrácii 10 µM. Vo všetkých testovaných látkach (s výnimkou karvedilolu) bola výrazne ovplyvnená extracelulárna tvorba RMK, kde boli najúčinnejšie prírodné látky, z liečiv ditiadén, znižujúci CHL o 60 %. Tvorbu intra­celulárnych RMK ovplyvnili prírodné látky v poradí kurkumín>N-f-5HT>quercetín. Arbutín bol neúčinný. Z terapeuticky používaných liečiv mal 20% účinnosť ditiadén.

Z testovaných látok v koncentrácii 10 µM významne zvyšoval aktivitu kaspázy ditiadén, z prírodných látok kurkumín a arbutín. Quercetín a N-f-5HT nevykazovali významné zvýšenie aktivity kaspázy (graf 3).

Aktiváciu stimulovanej neutrofilovej PKC v kon­centrácii 10 µM najvýznamnejšie ovplyvnil ditiadén, znížením o viac ako 35 %. Z prírodných látok bol účinný kurkumín a quercetín na hranici 25% zníženia a N-f-5HT s menej ako 20% účinnosťou (graf 4).

  • GRAf 2. Účinok karvedilolu (CARV), ditiadénu (DIT), arbutínu (ARB), kurkumínu (KUR), quercetínu (QUER) a N-feruloylsérotonínu (N-f-5HT) v koncentrácii 10 µM na chemiluminiscenciu izolovaných ľudských neutrofilných leukocytov, stimulovaných forbol-myristát-acetátom (PMA-0,5 µM), meranú extracelulárne a intracelulárne n = 6, x + SEM, *p < 0,05, **p < 0,01
  • Figure 2. Effect of carvedilol (CARV), dithiaden (DIT), arbutin (ARB), curcumin (KUR), quercetin (QUER) and N-feruloyl-serotonin (N-f-5HT) in 10 µM concentration on the chemiluminescence (CHL) of isolated neutrophils stimulated with phorbol-myristate-acetate (PMA-0.5 µM) measured extra- and intracellularly n = 6; x + SEM, *p < 0.05, ** p < 0.01
  • Graf 3. Aktivita kaspázy 3 v bezbunkovom systéme po ditiadéne (DIT), arbutíne (ARB), kurkumíne (KUR), quercetíne (QUER) a N-feruloylsérotoníne v 10 µM koncentrácii n = 6, x + SEM, *p < 0,05, **p < 0,01
  • Figure 3. Caspase-3 activity in cell-free system after dithiaden (DIT), arbutin (ARB), curcumin (KUR), quercetin (QUER) and N-feruloyl-serotonin (N-f-5HT) in 10 µM concentration n = 6; x + SEM, *p < 0.05, **p < 0.01
  • Graf 4. Aktivita proteínkinázy C v izolovaných ľudských neutrofiloch po inkubácii s ditiadénom (DIT), kurkumínom (KUR), quercetínom (QUER) a N-feruloyl-sérotonínom (N-f-5HT) v kon­centrá­cii 10 µM a po následnej stimulácii PMA n = 4, x + SEM, *p < 0,05, **p < 0,01
  • Figure 4. Activation of protein kinase C in isolated neutrophils after treatment with dithiaden (DIT), curcumin (KUR), quercetin (QUER) and N-feruloyl-serotonin (N-f-5HT) in 10 µM concentration and subsequent stimulationon with phorbol-myristate-acetate (PMA-0.15 µM). n = 4; x + SEM, *p < 0.05, **p < 0.01
  • Obrázok 5. Účinok ditiadénu (DIT), karvedilolu (CARV), arbutínu (ARB) a quercetínu (QUER) v koncentrácii 10 µM a následnej stimulácii N-formyl-metionyl-leucyl-fenyl-alanínom (fMLP-0.1 µM) na tvorbu superoxidu (SO2-) a uvoľnenie myeloperoxidázy (MPO) z izolovaných neutrofilov. n = 6, x + SEM, *p < 0,05, **p < 0,01
  • Figure 5. Effect of carvedilol (CARV), dithiaden (DIT), arbutin (ARB) and quercetin (QUER) in 10 µM concentration and subsequent stimulation with N-formyl-methionyl-leucyl-phenyl-alanine (fMLP-0.1 mM) on superoxide anion (SO-2) generation and myelo­peroxidase (MPO) liberation in isolated neutrophils. n = 6; x + SEM, *p < 0.05, **p < 0.01

Graf 5 demonštruje ovplyvnenie tvorby super­oxidového aniónu (SO-) a uvoľnenia myeloperoxidázy testovanými látkami v koncentrácii 10 µM, po stimulácii fMLP v izolovaných neutrofiloch. Tvorbu SO- znížil na hranici 10 % karvedilol a arbutín. Stimulované uvoľnenie myeloperoxidázy o viac ako 60 % znížil ditiadén, o 25 % quercetín a na hranici 10 % karvedilol a arbu­tín.

Diskusia

V početných štúdiách in vitro sme zistili, že celý rad terapeuticky používaných liečiv, ale najmä látok izolo­vaných z prírodných zdrojov významným spôsobom znižuje oxidatívne vzplanutie („oxidative burst“) v ľud­skej krvi, ako aj v izolovaných neutrofilných leukocytoch. Neutrofilné polymorfonukleárne leukocyty predstavujú primárnu obrannú líniu organizmu proti invadujúcim patogénom v procese fagocytózy. V ostatnom čase sa neutrofilom venuje zvýšená pozornosť z hľadiska ich účasti na iniciácii a progresii mnohých patologických procesov, ako je ischémia-reperfúzia, hyperurikémia, systémový lupus, akútny syndróm respiračnej tiesne, reumatoidná artritída a ďalšie, z hľadiska ich zvýšenej produkcie reaktívnych foriem kyslíka, dusíka a pro­teolytických enzýmov (2, 7, 31). Celý rad liečiv znižuje aktivitu RMK produkovaných neutrofilmi in vitro. Sem patria liečivá zo skupiny H1-antihistaminík (4, 10, 11, 20) a karvedilol (19), z ostatných látok pyridoindolový derivát stobadín (5) a celý rad látok prírodnej povahy, ako je glukomanan (6), arbutín (12) a kurkumín (13). Mnohé farmakologicky aktívne látky, ako sú glukoma­nany (6) a arbutín, významne znižovali oxidatívne vzplanutie krvných fagocytov v modeloch potkanej adjuvantnej artritídy (12).

Všetky testované látky zvyšujú aktivitu kaspázy 3 v bezbunkovom systéme v koncentrácii 10 µM. Nakoľko aktivácia kaspázy 3 je odrazom apoptotickej aktivity v tkanivách (21), možno predpokladať, že účinok ditiadénu, arbutínu, kurkumínu a quercetínu ovplyvní životnosť neutrofilov tak ako v prípade použitia pterostilbénu (26). Tento účinok by sa dal využiť v prípade reumatoidnej artritídy, kde je apoptóza neutrofilov predĺžená (8).

Ditiadén a quercetín v testovanej koncentrácii významne znižujú stimulovanú aktivitu PKC neutrofilov o 38, resp. 26 percent. Účinok kurkumínu a N-f-5HT bol menej významný s 26 a 17% znížením. Fosforylácia PKC je aktivačným markerom a predchádza fosforylácii NADPH-oxidázy zodpovednej za tvorbu RMK v bun­kách (22) a neutrofiloch (15).

Neprimeraná tvorba superoxidového aniónu a uvoľ­ne­nie MPO môžu výrazne ovplyvniť reakcie imunitného systému. Nakoľko ide o prvý z radu následne vzni­kajúcich RMK a MPO, okrem iného významne prispieva k tvorbe reaktívnych metabolitov kyslíka. Stanovenie účinku liečiv na tieto dva parametre pomôže k cha­rakterizácii mechanizmu účinku sledovaných látok. PMA, ako jeden zo stimulov tvorby superoxidu a uvoľ­nenia MPO, aktivuje proteinkinázu C, ktorú predstavuje skupina izoenzýmov líšiacich sa štruktúrou, kofaktormi aj špecifickosťou substrátov (9).

Študované látky v danej koncentrácii len v malej miere ovplyvnili stimulovanú tvorbu superoxidu, naopak, znižovali chemiluminiscenciu v krvi (graf 1) a prevažne extracelulárnu tvorbu RMK z izolovaných neutrofilov (graf 2), čo naznačuje, že sa podieľajú najmä na znížení koncentrácie iných RMK derivovaných zo vzniknutého superoxidu. Tomu nasvedčujú aj naše predchádzajúce práce, kde sme zistili, že karvedilol je slabý inhibítor superoxidu, ako sa zistilo v bezbunkových systémoch (1, 19). Karvedilol inhibuje tvorbu superoxidu a uvoľ­nenie MPO v izolovaných neutrofiloch podobným spô­sobom, bez ohľadu na odlišný mechanizmus stimulácie: opsonizovaný zymozán (OZ), fMLP (N-formyl-metionyl-leucyl-fenylalanín), PMA (forbol-12-myristát-13-acetát) (16, 25). Nakoľko sledované látky znižujú aj tvorbu samotného superoxidového aniónu, je pravdepodobné, že sa podieľajú na znížení celkovej koncentrácie RMK iným mechanizmom, na čo poukazuje ich schopnosť ovplyvniť aktiváciu PKC (obr. 4), pričom ďalším fakto­rom sú fyzikálnochemické vlastnosti sledovaných látok ovplyvňujúce v rôznej miere priamo membránu buniek (19, 27).

Z testovaných liečiv sú pre neutrofilné leukocyty toxické tricyklické antidepresíva, používané aj ako anal­getiká s protrahovaným účinkom (28). Značná pozor­nosť sa venuje selektívnemu ovplyvneniu neutrofilovej myeloproxidázy, jednému z hlavných faktorov tvorby RMK (17). Dôležitým miestom zásahu je skrátenie apop­tózy a zlepšenie fagocytózy aktivovaných neutrofilov v priebehu zápalu (14). Cielené štúdie zamerané na farmakologické ovplyvnenie funkcií aktivovaných neutrofilov poskytujú dôležitú informáciu o selektívnom zásahu chemických liečiv a prírodných látok na molekulovej úrovni.

Záver

V práci sme overili účinok dvoch terapeuticky používaných liečiv a štyroch prírodných látok na me­chanizmus oxidatívneho vzplanutia ľudských profesio­nálnych fagocytov z hľadiska ich účasti na oxidatívnom vzplanutí a z hľadiska tvorby reaktívnych foriem kyslíka. Oxidatívne vzplanutie v ľudskej krvi po stimulácii ovplyvnili testované látky v poradí účinnosti: N-feruloyl- sérotonín>quercetín>kurkumín>arbutín>ditiadén>karve­dilol. Tvorbu reaktívnych foriem kyslíka izolovaných neutrofilov intracelulárne ovplyvnili testované látky

v tom istom poradí, karvedilol bol neúčinný. Zhášanie extracelulárnych foriem reaktívnych metabolitov kyslíka, merané chemiluminiscenčne, bolo v poradí účinnosti: N-feruloyl-sérotonín>kurkumín>quercetín>ditiadén. Arburín a karvedilol boli neúčinné. Všetky testované látky zvyšovali aktivitu kaspázy v bezbunkovom systé­me, čo môže priaznivo ovplyvniť apoptózu neutrofilov. Zníženie stimulovanej aktivácie proteínkinázy C neutrofilov významne spôsobil ditiadén, kurkumín, quercetín a N-feruloyl-sérotonín. Aktiváciu myelo­peroxidázy neutrofilov významnejšie znížili karvedilol, ditiadén, quercetín a arbutín, v porovnaní so znížením tvorby superoxidového aniónu, čo poukazuje na skutočnosť, že na znížení celkovej koncentrácie reaktívnych metabolitov kyslíka sa látky podieľajú aj iným mechanizmom než potlačením aktivácie pro­teinkinázy C.

Poďakovanie: Práca vznikla s podporou vedeckých projektov VEGA 2/0003/07 a APVV 0315-07.

Literatúra

1.    Asbrink, S., Zickert, A., Bratt, J., Gyllenhammar, H., Palmblad, J.: No effect of carvedilol on nitric oxide generation in phagocytes but modulation of production of superoxide ions. Biochem Pharmacol, 59, 2000, č. 8, s. 1007-1013.
2.    Cascao, R., Rosario, H.S., Fonseca, J.E.: Neutrophils: Warriors and commanders in immune mediated inflammatory diseases. Acta Rheumatol Port, 34, 2009, č. 2, s. 313-326.
3.    CRIMI, E., SICA, V., WILLIAMS-IGNARRO, S., ZHANG, H., SLUTSKY, A.S., IGNARRO, L.J., NAPOLI, C.: The role of oxidative stress in adult critical care. Free Rad Biol Med, 40, 2006, č. 3, s. 398-406.
4.    Drábiková, K., Jančinová, V., Nosáľ, R., Pečivová, J., Mačičková, T.: Extra- and intracellular oxidant production in phorbolmyristate acetate stimulated human polymorphonuclear leukocytes: modulation by histamine and H1-antagonist loratadine. Inflamm Res, 55, 2006, č. 1, s. 19-20.
5.    Drábiková, K., Jančinová, V., Nosáľ, R., Pečivová, J., Mačičková, T., Turčáni P.: Inhibitory effect of stobadine on FMLP-induced chemiluminescence in human whole blood and isolated polymorphonuclear leukocytes. Luminescence, 22, 2007, č. 2, s. 67-71.
6.    Drábiková, K., Perečko, T., Nosáľ, R., Bauerová, K., Poništ, S., Mihálová, D., Kogan, G., Jančinová, V.: Glucomanan reduces neutrophil free radical production in vitro and in rats with adjuvant arthritis. Pharmacol Res, 59, 2009, č. 6, s. 399-403.
7.    Fialkow, L., Wang, Y., Downey, G.P.: Reactive oxygen and nitrogen species as signaling molecules regulating neutrophil functions. Free Rad Biol Med, 42, 2007, č. 2, s. 153-164.
8.    Hallett, J.M., Leitch, A.E., Rilez, N.A., Duffin, R., Haslett, C., Rossi, A.G.: Novel pharmacological strategies for driving inflammatory cell apoptosis and enhancing the resolution of inflammation. Trends Pharmacol Sci, 29, 2008, č. 5, s. 250-257.
9.    Hug, H., Sarre, T.F.: Protein kinase C isoenzymes divergence in signal transduction? Biochem J, 291, 1993, č. 2, s. 329-343.
10.    Jančinová, V., Drábiková, K., Nosáľ, R., Holomáňová, D.: Extra- and intracellular formation of reactive oxygen species by human neutrophils in the presence of pheniramine, chlorphenira­mine and brompheniramine. Neuroendocrinol Lett, 27, 2006a, č. 2, s. 141-143.
11.    Jančinová, V., Drábiková, K., Nosáľ, R., Račková, L., Májeková, M., Holomáňová, D.: The combined luminol-isoluminol chemiluminescence method for differentiation between extracellular and intracellular oxidant production by neutrophils. Redox Rep, 11, 2006b, č. 3, s. 110-116.
12.    Jančinová, V., Petríková, M., Perečko, T., Drábiková, K., Nosáľ, R., Bauerová, K.: Inhibition of neutrophil oxidative burst with arbutin. Effects in vitro and in adjuvant arthritis. Chem Listy, 101, 2007, č. 2, s. 189-191.
13.    Jančinová, V., Perečko, T., Nosáľ, R., Koštálová, D., Bauerová, K., Drábiková, K.: Decreased activity of neutrophils in the presence of difeluroylmethane (Curcumin) involves protein kinase C inhibition. Eur J Pharmacol, 12, 2009, č. 1-3, s. 161-166.
14.    Kebir, D.E., Filep, J.G.: Role of neutrophil apoptosis in the reso­lution of inflammation. Sci World J, 10, 2010, č. 12, s. 1731-1748.
15.    Klink, M., Jastrzembska, K., Bednarska, K., Banasik, M., Sulowska, Z.: Effect of nitric oxide donors on NADPH oxidase signaling pathway in human neutrophils in vitro. Immunology, 214, 2009, č. 8, s. 692-702.
16.    Mačičková, T., Pečivová, J., Nosáľ, R., Lojek, A., Pekarová, M., Cupaníková, D.: Inhibition of superoxide generation and myeloperoxidase release by carvedilol after receptor and nonreceptor stimulation of human neutrophils. Neuroendocrinol Lett, 29, 2008, č. 5, s. 790-793.
17.    Malle, E., Furtmuller, P.G., Sattler, W., Obinger, C.: Myeloperoxidase: a target for new drug development? Br J Pharmacol, 152, 2007, č. 6, s. 838-854.
18.    Nosáľ, R., Jančinová, V.: Cationic amphiphilic drugs and platelet phospholipase A2 (cPLA2). Thromb Res, 105, 2002, č. 4, s. 339-345.
19.    Nosáľ, R., Jančinová, V., Číž, M., Drábiková, K., Lojek, A., Fábryová, V.: Inhibition of chemiluminescence by carvedilol in the cell-free system, whole human blood and blood cells. Scand J Clin Lab Invest, 65, 2005, č. 1, s. 55-64.
20.    NosáĽ, R., Drábiková, K., Jančinová, V., Moravcová, J., Lojek, A., Číž, M., Mačičková, T., Pečivová, J.: H1-antihistamines and oxidative burst of professional phagocytes. Neuroendocrinol Let, 30, 2009, č. 1, s. 133-136.
21.    Pan, M.H., Chang, Z.H., Badmaev, V., Nagabhushanam, K., Ho, C.T.: Pterostilbene induces apoptosis and cell cycle arrest in human gastric carcinoma cells. J Agricult Food Chem, 55, 2007, č. 19, s. 7777-7785.
22.     Pan, M.H., Chiou, Y.S., Chen, W.J., Wang, J.M., Badmaev, V., Ho, C.T.: Pterostilbene inhibited tumor invasion via suppressing multiple signal transduction pathways in human hepato­cellular carcinoma cells. Carcinogenesis, 30, 2009, č. 7, s. 1234-1242.
23.    Peake, J., Suzuki, K.: Neutrophil activation, antioxidant supple­ments and exercise-induce oxidative stress. Exerc Immunol Rev, 10, 2004, č. 2, s. 129-141.
24.    Pečivová, J., Mačičková, T., Lojek, A., Gallová, L., Číž, M., Nosáľ, R., Holomáňová, D.: Effect of Carvedilol on reactive oxygen species and enzymes linking innate and adaptive immunity. Neuroendocrinol Lett, 27, 2006, č. 2, s. 160-163.
25.     Pečivová, J., Mačičková, T., Lojek, A., Gallová, L., Číž, M., Nosáľ, R., Holomáňová, D.: In vitro effect of carvedilol on professional phagopcytes. Pharmacology, 79, 2007, č. 2, s. 86-92.
26.    Perečko, T., Drábiková, K., Račková, L., Číž, M., Podborská, M., Lojek, A., Harmatha, J., Šmidrkal, J., Nosáľ, R., Jančinová, V.: Molecular targets of the natural antioxidant pterostilbene: effect on protein kinase C, caspase-3 and apoptosis in human neutrophils in vitro. Neuroendocrinol Lett, 31, 2010, č. 2, s. 101-107.
27.    Petríková, M., Jančinová, V., Nosáľ, R., Májeková, M., Danihelová, E.: Antiplatelet activity of carvedilol in comparison to propranolol. Platelets, 13, 2002, č. 8, s. 479-485.
28.    Ploppa, A., Ayers, D.M., Johannes, T., Unertl, K.E., Durieaux, M.E.: The inhibition of human neutrophil phagocytes and oxidative burst by tricyclic antidepressants. Anesthesia Analgesia 107, 2010, č. 4, s. 1229-1235.
29.    Robinson, J.M.: Phagocytic leukocytes and reactive oxygen species. Histochem Cell Biol, 131, 2009, č. 4, s. 465-469.
30.    Splettstosser, W.D., Schuff-Werner, P.: Oxidative stress in phagocytes – „The enemy within”. Microsopy Res Tech, 57, 2002, č. 4, s. 441–455.
31.    Wright, H.L., Moots, R.J., Bucknall, R.C., Edwards, S.W.: Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology, 49, 2010, č. 9, s. 1618-1631.

Posledná úprava Utorok, 24 Máj 2011 12:10  

Reklamný prúžok
Reklamný prúžok
Reklamný prúžok

Partneri

Reklamný prúžok